Practica 4 "Esterilización"

Objetivo: Esterilizar el material con calor húmedo.

Introducción:

Esterilización: proceso físico o químico que destruye toda forma de vida microbiana, incluidas las esporas.
FUNDAMENTOS DE PROCEDIMIENTOS DE ESTERILIZACIÓN
El procedimiento de esterilización se llevo a cavo en un laboratorio por medio de calor húmedo en el cual se utilizaron las técnicas de ebullición y vapor de agua a presión, utilizando mechero, alcohol y autoclave respectivamente.
Calor Húmedo.
La esterilización con calor húmedo (vapor d agua) es mucho más rápida y eficaz que el calor seco debido a que las moléculas de agua desnaturalizan las proteínas de forma irreversible mediante rotura de los uniones H entre los grupos peptídico a temperaturas relativamente bajas.
Autoclave: horno a presión, consiste en una cámara en la que el aire puede ser sustituido por vapor de agua sometida a presión. Se opera a 121ºC y 1 atm. De presión durante 20 minutos. De esta forma se consigue destruir todas las formas vegetativas y esporas. Se lo utiliza para esterilizar todo material resistente a esa temperatura y es muy utilizado para la esterilización de medios de cultivos de microorganismos para descartar, lencería, uniformes, instrumentos etc.
Entre sus desventajas están que no permite la esterilización de materiales sensibles al calor y materiales no miscibles con el agua como aceites o grasas.

Material Parte I:
2 pipetas graduadas.
2 cajas petri.
Papel para envolver.
Cinta testigo.

Equipo Parte I:
Autoclave.

Parte II

Primero se investigaron las normas que iban de a acuerdo a nuestro producto, para poder saber que pruebas se iban a realizar:

1. Coliformes totales y fecales.
2. hongos y levaduras.

Realizamos los cálculos de acuerdo a como se manejaba en el reactivo:
1.-
Caldo lauril sulfato y triptoza:

Muestra - 100gr 71.2gr – 1000ml
71.2gr - 1000gr X - 54 ml

2.- 3.8448gr.
Hongos y levaduras:

39gr – 1000ml 2.496gr
X - 64ml de agua

Material Parte II:
Mechero de bunsen.
8 tubos de ensayo.
12 tubos de ensayo con taparosca.
4 cajas petri.
2 Matraz erlenmeyaer con taparosca.
Mortero de mano.
8 pipetas graduadas.
Papel para envolver.
Cinta testigo.

Reactivos:
Muestra del producto.
Agua
Dextrosa Agar papa.

Equipo Parte I:
Autoclave.


Metodología.

Parte I
a) Lava y seca tu material.
b) Introduce 300ml de H2O en el matraz erlenmeyer de 500ml tapa con la rosca de modo que tenga un sellado hermético
c) Envuelve la caja de petri.
d) Envuelve la pipeta.
e) Prepara el medio de cultivo como indica la etiqueta del medio.
f) Etiqueta tu material: No. De equipo, grupo, Fecha.

Parte II

a) Preparación de medios de cultivo (Sólido y líquido).

b) Esterilización de medios de cultivo (sólido y líquido).

c) Esterilización de desechos biológicos (medios sólidos y líquidos).

Parte 1
Como utilizar el autoclave, acomodar el material, y medidas de seguridad a la hora de esterilizar.
Primero en la parte de abajo del autoclave colocamos las cajas de petri envueltas y selladas, para después pasar a colocar algún vaso de precipitado o los matrazes, las pipetas se colocan en un cilindro que esta aparte que es de acero inoxidable, debemos tomar en cuenta que hay que tener mucho cuidado a la hora de su manejo, el matraz debe de taparse con la rosca de modo que no tuviera un sellado hermético pero que tampoco quedara floja la tapa. Los materiales de laboratorio se deben de envolver con papel de estraza y sellarlo con cinta testigo, donde se coloca el No. De equipo e integrantes. Para envolver una pipeta se ocupa aproximadamente un pedazo de papel de 2 x 20 cm. Y para las cajas de petri uno de 20 x20 cm, corroborando que quede completamente cubierto para evitarse contaminación a la hora de sacarlo.
FUNCIONAMIENTO
El proceso completo de esterilización en un autoclave se compone de diferentes fases:
FASE DE PURGADO. A medida que la resistencia calienta el agua del fondo del calderín, se va produciendo vapor que desplaza el aire, haciéndolo salir por la válvula de purgado que está abierta. Esta fase termina cuando se alcanza la temperatura de esterilización.
FASE DE ESTERILIZACIÓN. Una vez cerrada la válvula de purgado y alcanzada la temperatura de esterilización previamente seleccionada se inicia el proceso de esterilización.
FASE DE DESCARGA. Terminado el proceso de esterilización, deja de funcionar la resistencia calefactora, con lo que deja de producirse vapor y la presión y temperatura del calderín empiezan a bajar poco a poco.

Hay que tener en cuenta algunas normas para una correcta esterilización del material:

Para que la esterilización de medios de cultivo sea eficaz, la temperatura y el tiempo seleccionados deben alcanzarse en todo el líquido. Como quiera que la transmisión del calor en el líquido de los recipientes se realiza de fuera hacia dentro, es evidente que la eficacia del proceso dependerá del volumen de líquido. En general, no conviene esterilizar juntos recipientes grandes y pequeños. En todo caso la selección de la temperatura y tiempo se efectuará según sea el volumen de los recipientes
Los recipientes con cierre hermético deben ser introducidos en el autoclave sin cerrar totalmente el tapón, para facilitar la entrada del vapor durante el proceso. Al vaciar el autoclave después de la esterilización procederemos a cerrar totalmente estos recipientes.

Parte ll
Procedimiento:

Coliformes totales
Pesar la cantidad necesaria de caldo lauril, para después disolverla en el vaso de precipitado con agua. Enseguida se colocó en los tubos de ensaye las campanitas con el orificio hacia abajo. Pasando a colocar en cada tubo la triptosa con una pipeta. Las pusimos en el autoclave.
Después de sacar los tubos del autoclave:
Agregar la muestra (gelatina) a cada tubo con la pipeta.
Primero a los 4 tubos marcados se agregó de un tubo a otro sucesivamente.
Eran 12 tubos en total, primero marcamos 4, y a esos 4 tubos los agrupamos con otros tres, marcándolos para que quedaran en grupos, La solución la agregamos de la siguiente manera:
Del tubo # 1 agregamos solución al tubo de su grupo, y sucesivamente de ese tubo se agregó al que sigue y así hasta abarcar los tres, continuando con el proceso con los otros tres restantes.
Para realizar esto tuvimos que marcar 4 pipetas para no contaminar.
Pasamos a colocar los tubos en el autoclave para después verificar cuales salieron contaminados.

Coliformes fecales:
Pesamos el medio de cultivo de acuerdo a la cantidad que se maneja, se preparó el medio disolviendo en agua el agar billis rojo de violeta.
Para la cocción en las cajas de petri colocamos el medio de cultivo.
Prendimos el mechero y esterilizamos el asa, para introducirla en el tubo de coliformes totales y pasarla por la caja de petri, teniendo cuidado de no romper la especie de gelatina que se forma.

Hongos y levaduras:
Pesamos la cantidad necesaria que utilizaremos para el medio de cultivo. Disolvemos el agar papa dextrosa en el agua.
Y en el otro matraz disolvemos la muestra con agua esterilizada.
En el tubo de ensaye se pone la muestra con ayuda de la pipeta.
Medio de cultivo: En las cajas de petri colocamos 1ml del medio con ayuda de la pipeta, agregamos finalmente a las cajas de petri cada una de las muestras de los tubos y etiquetamos de la 1-4. Después se verificó que tan contaminada estaba la muestra y se contó el número de hongos o levaduras que tenía.

Resultados:
Con el procedimiento realizado de la cinta testigo y al obtener estéril las cajas testigo, las pipetas, los medios de cultivo, los desechos biológicos y el grado de conformidad sobre esta practica realizada fue muy bueno, a pesar de que no fue al 100% ya que para acercarse a esta cifra aproximadamente necesitábamos realizar otra prueba, colocando otra caja testigo sin sembrar, e incubarla junto con otra que este sembrada.

Se considera imposible llegar a un 100% de seguridad en el esterilizado, pero realizando las pruebas necesarias, podemos llegar a un aproximado (98%) y obtener mejores resultados en la esterilización.

En esta nueva práctica de pruebas microbiológicas se aprendió a esterilizar materiales y sustancias por medio de calor húmedo, ó bien, mediante el vapor. Metimos a esterilizar diferentes materiales como, cajas de petri, matraces, erlenmeyer, pipetas, tubos de ensayo, etc. El material duró un lapso de 45 minutos esterilizándose, después, el material estuvo listo para que pudiéramos cultivar los microorganismos sin ningún problema de contaminación, y así, tener los resultados del alimento.

Con el procedimiento realizado se logró esterilizar los instrumentos que se utilizaron para obtener los resultados, como son cajas de Petri, tubos de ensayo, pipetas, matraces, etc., mismos que se metieron a la autoclave, (Instrumento funciona conservando el calor controlando su temperatura), también se utilizó para hacer las pruebas microbiológicas para conseguir los datos de la inocuidad de el producto elaborado (gelatina de zanahoria) para detectar la presencia de hongos y levaduras, coliformes totales y fecales que afectan la salud del consumidor.
El material se debe dejar reposar por un lapso de 45 minutos aprox. en la incubadora logrando alcanzar un material estéril para poder cultivar microorganismos sin problemas de contaminación y solo tener los resultados del alimento.
Se nos informó que las soluciones que se agregan a las cajas de Petri deben ser tiradas a la basura por que tapan las tuberías.
Esto sirvió para obtener los conocimientos que posteriormente se utilizarán en otros estudios de alimentos y microbiología.
Los artículos limpios pueden ponerse en cestillos de alambre, no así el material contaminado el cual debe estar colocado en un recipiente de fondo sólido a una altura no mayor a 8 cm., asimismo deben dejarse grandes espacios de aire alrededor de cada recipiente y ninguno debe estar totalmente cerrado.
La mesa del laboratorio también fue esterilizada para así poder realizar nuestros cultivos.

En esta práctica se aprendió a esterilizar material por medio de calor húmedo para realizar pruebas microbiológicas.
Una buena esterilización por autoclave depende de la eliminación de todo el aire de la cámara y la carga de los materiales que se van a esterilizar los cuales deben ser tapados sin apretarse.
Discusión:
En base a los cuidados extremos que tuvimos mediante el proceso de esterilización, el lapso que esperamos, y los resultados que obtuvimos, se llegó al término que sí logramos esterilizar todo el material tal y como lo habíamos planeado. También nos dimos cuenta que, si no utilizamos el proceso tal y como lo indica, y de igual forma, un cuidado extremo, se afectarán los resultados y las pruebas microbiológicas.

Conclusión:
Con el método utilizado ‘’ calor húmedo” se llegó a la conclusión de que es un método efectivo el cual no deja rastros de microorganismos en el material del laboratorio sometido al mismo.

Bibliografía:
Autor: María García, José Carlos.
Título: Técnicas de descontaminación
Editorial: Anónima.
Lugar: México.
Año: 2004
Pág.: 117-120
Autor: Hans G. Schlegel
Título: Microbiología general.
Editorial: Omega
Lugar: Reino Unido
Año: 1997
Pág: 78

Presentado por:
Edelmira Sánchez Alcaraz
Alejanddra D. Rubio Mora.
Cristina Castañeda Godinez.
Emmannuel Rizo Belloso.
Cinthia C. Chavez Rodriguez.
Ivan Medina Carrillo.
Francisco J. García Guitierrez.